克隆感受態(tài)細(xì)胞是如何被制作的？

　　克隆感受態(tài)細(xì)胞的理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，吸收周圍環(huán)境中的DNA分子，使其處于最適攝取和容納外來(lái)DNA的生理狀態(tài)。

 

　　它主要原理就是通過(guò)處理使細(xì)胞的通透性變大，直觀的說(shuō)，使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。由于細(xì)胞膜的流動(dòng)性，這種孔洞會(huì)被細(xì)胞自身所修復(fù)。

 

　　克隆感受態(tài)細(xì)胞的制作方法：

　　CaCl2法：

　　1、將快速生長(zhǎng)的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2+會(huì)使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來(lái)，離開所在區(qū)域，誘導(dǎo)細(xì)胞成為克隆感受態(tài)細(xì)胞；

　　細(xì)胞壁通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物。

　　聯(lián)合其它的二價(jià)金屬離子（如Mn、Co）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高100～1000倍。

　　2、此時(shí)，將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激（90s），細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨機(jī)出現(xiàn)許多間隙，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。

　　3、將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出帶有外源DNA分子的陽(yáng)性克隆。

 

　　電轉(zhuǎn)法：

　　電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌，轉(zhuǎn)化率最高能達(dá)到109~1010轉(zhuǎn)化子/ug閉環(huán)DNA。因操作簡(jiǎn)便，愈來(lái)愈為人們所接受。