Stable電轉感受態細胞

Stable電轉感受態細胞

產品規格CAT#: BFNC86048-01(5×50ul)/BFNC86048-02(20×50ul)

Stable Electroporation-Competent Cell                 50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質期)：                                         -80℃（6個月）

基因型

F' proA+B+ lacI^q ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (Tet^R) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (Str^R) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS -mcrBC)

產品說明

Stable電轉感受態細胞只能用于電擊轉化，不可用于熱激轉化。Stable菌株是NEB公司開發的高轉化效率菌株，是逆轉錄病毒/慢病毒載體系統推薦使用的菌株，特別適合慢病毒或具有末端重復序列DNA的片段的克隆。基因組含有重組酶recA1 rel A1突變，可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率；同時含有核酸酶endA1突變，避免了提取質粒過程中核酸酶的污染，大大提高了高純度病毒質粒的產量和質量。lacZΔM15的存在使Stable可用于藍、白斑篩選，此菌株具有四環素和鏈霉素抗性。

青旗生物開發的Stable電轉感受態細胞適用于大質粒的構建或者各種具有末端重復序列的復雜DNA文庫構建，經特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率>1×10¹⁰ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的Stable電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質粒或連接產物)并用手bo打EP管底輕輕混勻，避免產生氣泡，立即插入冰中。

   A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19；

   B. 對于連接產物，請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)或ddH2O重懸，             DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數，也可按所用電轉儀推薦的參數操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基（室溫），用1 ml槍吹吸電擊杯底部數次混勻后，轉移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養基至10 ml。傾斜放入搖床，30℃，250 rpm復蘇90分鐘。

當質粒中含有不穩定片段時，30℃培養可降低錯誤重組的概率，若轉化control pUC19計算轉化效率，則                         需37℃，225 rpm復蘇60分鐘

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的LB平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個）。將平板倒置放于30℃培養箱過夜培養20-24小時。

Stable電轉感受態細胞

注意事項

1. 對不穩定DNA的片段的克隆或逆轉錄病毒/慢病毒載體的構建，涂板后平板應在30℃培養，以減少發生錯誤重組的概率。2. 制備高純度病毒質粒時，應使用新鮮轉化的平板接菌，新鮮菌液提取質粒，菌液不可低溫保存后提取質粒。

3. 感受態細胞盡量在冰中緩慢融化。插入冰中10分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。混入目的DNA時應輕柔操作。

4. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

5. 電轉感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡，氣泡會增加弧光放電風險。

6. 當DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉化效率急劇下降。

7. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導，增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

8. 若轉化大質粒或想獲得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

9. 對于連接產物轉化，盡量轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率，增加弧光放電的風險。

10. 混入質粒時應輕柔操作，吸取感受態細胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質粒或連接產物可相應減少終用于涂板的菌量。

11. 電轉感受態細胞盡量保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。